Хроматографирование осуществляли при темпера­туре 20 - 25 °С. По окончании элюирования пластины подсушивали на воздухе и обрабатывали детектирую­щим реагентом при помощи лабораторного стеклянно­го пульверизатора. Сканирование зон проводили с ис­пользованием сканирующего денситометра “Shimadzu CS-9000" (Япония). Сравнивали качество зон, получа­емое при хроматографировании в трех, наиболее часто рекомендуемых элюирующих системах: I. хло­роформ - метанол - вода (30:17:3): II. н-бутанол - этанол - аммиак (7:2:5); III. н-бутанол - вода - ук­сусная кислота (4:5:1), верхний слой; IV. бензол - этилацетат (1:1) (для сапонинов сахарной свеклы). денситометр dexxum fujitora.com

В качестве детектирующих реактивов использовали 25 % спиртовый раствор фосфорновольфрамовой кис­лоты (малиновые пятна сапонинов на белом фоне). наиболее часто применяемый для количественных ТСХ-определений подобных соединений и 10 % спир­товый раствор фосфорномолибденовой кислоты, реко­мендуемый для проявления зон тритерпеноидов [13] (зоны сапонинов темно-синие на желтом фоне). Обра­ботка пластин парами аммиака в последнем случае по­зволяет обесцветить фон и повысить контрастность пятен.

В результате проведенных исследований были вы­браны оптимальные для денситометрического опреде­ления условия проведения хроматографического про­цесса. Лучшими из трех типов пластин были призна­ны "Армсорб" для ВЭТСХ. Высокой эффективности процесса способствует тонкий (II0 мкм) и однород­ный по фракционному составу (5—10 мкм) слой силикагеля, обеспечивающий хорошее разделение и минимальное размывание зон уже при подъеме фронта рас­творителя на 6 см. Почти не уступают им по разделительной способности пластины "Сорбфил", но время элюирования на них почти вдвое больше. Пластины "Силуфол" при достаточно высокой скорости элюирования позволяют разделить компоненты при большем хроматографичесюм пути, что приводит к некоторому размыванию зон, однако их использование также возможно.

Элюирование может быть проведено достаточно ка­чественно в любой из первых трех элюирующих сис­тем. I дает выигрыш во времени, IV позволяет получить лучшее разделение сапонинов сахарной свеклы, чем первые три.

Оба детектирующих реагента дают достаточно ста­бильное окрашивание зон при проведении сканирова­ния в течение 1 - 2 ч с момента проявления. По исте­чении этого срока зоны сапонинов на пластинах, обра­ботанных фосфорнонольфрамовой кислотой, изменяют окраску от малиновой до фиолетовой, что может привести к искажению результатов количест­венного анализа при сканировании. Обработка фосфорномолибденовой кислотой в этом случае более предпочтительна. При хранении в защищенном от све­та месте пластины с зонами, проявленными этим реак­тивом, дали вполне воспроизводимые результаты по истечении нескольких месяцев с момента проявления.

Предел обнаружения сапонинов составил 5 мкг в пробе при проявлении фосфорновольфрамовой кисло­той и 0,5 мкг в пробе при проявлении фосфорномо-либденовой кислотой. Обработка парами аммиака по­зволила снизить предел обнаружения сапонинов в по­следнем случае до 0,2 мкг в пробе.

Количественное определение сапонинов методом ТСХ с использованием сканирующей денситометрии проводили на пластинах "Армсорб" (скорость хроматографирования в этом случае в 2 раза выше) или "Сорбфил", во II и III элюирующей системе (как со­держащих менее токсичные компоненты). Детектиро­вание зон осуществляли 10 % раствором фосфорномолибденовой кислоты. Объем наносимой пробы не бо­лее 5 мкл, высота подъема фронта элюента — 6 см, время элюирования 30 - 60 мин. Длина волны при ска­нировании λ = 675 нм. После обработки пластин сапо­нины аралии и сахарной свеклы проявляются в виде трех зон разной интенсивности.