VR=Vo+KdVi.

Отсюда следует еще одно существенное отличие эксклюзионной хроматографии: в данном методе разделение заканчивается до выхода пика растворителя, в то время как в других вариантах ВЭЖХ компоненты смеси элюируются после пика растворителя.

Параметр k' в эксклюзионной хроматографии обычно не используют. Его можно выразить уравнением

k' = KdVi / Vo.

Для большинства современных сорбентов Vi ≈ Vo, поэтому k' ≈ Kd.

Связь между удерживаемым объемом и молекулярной массой (или размером молекул) образца описывается калибровочной кривой (рис. 2.16). Каждый сорбент характеризуется своей калибровочной кривой, по которой легко оценить область разделяемых на нем молекулярных масс. Точка А соответствует пределу эксклюзии, или мертвому объему колонки Vo. Все молекулы, масса которых больше, чем в точке А, будут элюироваться одним пиком с удерживаемым объемом Vo. Точка В отражает предел проникания, и все молекулы, масса которых меньше, чем в точке В, также будут выходить из колонки одним пиком с удерживаемым объемом Vt. Между точками А и В располагается диапазон селективного разделения. Соответствующий ему объем Vi=Vt-Vo часто называют рабочим объемом колонки. Отрезок CD представляет собой линейный участок калибровочной кривой, построенной в координатах VR–IgM. Этот участок описывается уравнением

Vr = C1 – C2lgM,

где C1 – отрезок, отсекаемый на оси ординат продолжением отрезка СD, C2 – тангенс угла наклона этого отрезка к оси ординат.

Величину С2 называют разделительной емкостью колонки; ее выражают числом миллилитров растворителя, приходящегося на один порядок изменения молекулярной массы. Чем больше разделительная емкость, тем селективнее разделение в данном диапазоне масс. В нелинейных областях калибровочной кривой (участки АС и BD) в связи с уменьшением С2 эффективность фракционирования заметно снижается. Кроме того, нелинейная связь между IgM и Vr существенно усложняет обработку данных и снижает точность результатов. Поэтому всегда нужно стремиться выбирать колонку (или набор колонок) так, чтобы разделение анализируемого полимера протекало в пределах линейного участка калибровочной кривой.

Если какое-либо вещество элюируется с удерживаемым объемом больше Vt, то это указывает на проявление других механизмов разделения (чаще всего адсорбционного). Адсорбционные эффекты обычно проявляются на жестких сорбентах, но иногда наблюдаются и на полужестких гелях, видимо, из-за повышенного сродства к матрице геля. Примером может служить адсорбция ароматических соединений на стирол-дивинилбензольных гелях.

Рис. 2. Калибровочная кривая

Советские исследователи предложили теорию единого механизма жидкостной хроматографии полимеров на жестких гелях, из которой следует, что изменением параметров взаимодействия в системе полимер – сорбент – растворитель можно переходить от адсорбционного механизма к эксклюзионному и наоборот. В общем случае в эксклюзионной хроматографии нужно стремиться полностью подавить адсорбционные и другие побочные эффекты, так как они, особенно при исследовании молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров, могут существенно исказить результаты анализа.