Эксклюзионная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами.

В отличие от остальных вариантов ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбента, роль твердого наполнителя в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Поэтому применение термина «сорбент» к данным наполнителям в определенной степени условно.

Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне практически любых молекулярных масс – от 102 до 108, что делает его незаменимым для исследования синтетических и биополимеров.

По традиции процесс, проводимый в органических растворителях, все еще часто называют гель-проникающей, а в водных системах – гель-фильтрационной хроматографией. Принят единый термин, который происходит от английского «Size Exclusion» – исключение по размеру – и в наиболее полной степени отражает механизм процесса.

Детальный разбор существующих представлений о весьма сложной теории процесса эксклюзионной хроматографии проведен в монографиях. Мы рассмотрим только принципиальные основы метода, достаточные для практической работы.

Объем эксклюзионной колонки можно выразить суммой трех слагаемых:

Vс=Vо+Vi+Vd,

где Vо – мертвый объем – объем растворителя между частицами сорбента (объем подвижной фазы); Vi – объем пор, занятый растворителем (объем неподвижной фазы); Vd – объем матрицы сорбента без учета пор.

Полный объем растворителя в колонке Vt (его часто называют полным объемом колонки, так как Vd не принимает участия в хроматографическом процессе) представляет собой суммy объемов подвижной и неподвижной фаз:

Vt=Vо+Vi.

Удерживание молекул в эксклюзионной колонке определяется вероятностью их диффузии в поры и зависит от соотношения размеров молекул и пор, что схематически показано на рис. 2.15. Коэффициент распределения Kd, как и в других вариантах хроматографии, представляет собой отношение концентраций вещества в неподвижной и подвижной фазах:

Кd = Сi / Со.

Так как подвижная и неподвижная фазы имеют одинаковый состав, то Kd вещества, для которого обе фазы одинаково доступны, равен единице. Эта ситуация реализуется для молекул с самыми малыми размерами (в том числе и молекул растворителя), которые проникают во все поры (см. рис. 2.15) и поэтому движутся через колонку наиболее медленно. Их удерживаемый объем равен полному объему растворителя Vt.

Рис. 1. Модель разделения молекул по размеру в эксклюзионной храматографии

Все молекулы, размер которых больше размера пор сорбента, не могут попасть в них (полная эксклюзия) и проходят по каналам между частицами. Они элюируются из колонки с одним и тем же удерживаемым объемом, равным объему подвижной фазы Vo. Коэффициент распределения для этих молекул равен нулю.

Молекулы промежуточного размера, способные проникать только в какую-то часть пор, удерживаются в колонке в соответствии с их размером. Коэффициент распределения этих молекул изменяется в пределах от нуля до единицы и характеризует долю объема пор, доступных для молекул данного размера. Их удерживаемый объем определяется суммой Vo и доступной части объема пор: