Адаптация штаммов-продуцентов к стабильным изотопам.
Статьи / Полупрепаративный микробиологический синтез биологически активных соединений, меченных стабильными изотопами водорода и углерода / Адаптация штаммов-продуцентов к стабильным изотопам.
Страница 4

'Данные (1-10) приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.

Данные 10' приведены для адаптированного В. methylicum.

Выращивание проводили в периодических условиях в колбах Эрленмейера объемом 500 мл с наполнением средой до 100 мл при 35-370С в условиях интенсивной аэрации на орбитальном шейкере. 2Н -и 13С-меченые аминокислоты выделяли в чистом виде фракционированием культуральных жидкостей, включая диализ через полупроницаемую коллодиевую мембрану, обработку метанолом (-50С), ионнообменную хроматографию на катионообменнике UR-30 (элюент 0.2 н натрийцитратный буфер), химическую дериватизацию в метиловые эфиры Днс- и Кбз-производных аминокислот, разделение методом ОФ ВЭЖХ на октадецилсилановой смоле Сепарон С18 (элюент ТФУ-ацетонитрил, 80:20).

Летучие производные аминокислот синтезировали первичной химической обработкой культуральной жидкости Днс-хлоридом (Кбз-хлоридом) в 4 н растворе NaOH в ацетоне, используя пяти-кратный избыток реагента. Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с моно-производными синтезировались ди-Кбз,(Днс)-лизин, ди-Кбз,(Днс)-гистидин, О,N-ди-Кбз,(Днс)-тирозин, O,N-ди-Кбз,(Днс)-серин, O,N-ди-Кбз,(Днс)-треонин и N,S-ди-Кбз,(Днс)-цистеин. Из аргинина синтезировался три-Кбз,(Днс)-аргинин. Метиловые эфиры производных аминокислот синтезировали в условиях, исключающих обратный изотопный (Н-2Н)-обмен в ароматических аминокислотах за счет вторичной дериватизации по карбоксильной группе диазометаном. Для лизина и тирозина пики [М]+. соответствовали метиловым эфирам ди-производных аминокислот - a, e-ди-Кбз, (Днс)-лизину и О, N-ди-Кбз, (Днс)-тирозину). Конечный выход 2Н -и 13С-меченых аминокислот составил 65-90, а хроматографическая чистота - 87-95%.

Во всех анализируемых образцах культуральной жидкости наряду с основными секретируемыми аминокислотами обнаружены 5-6 ммоль аланина, валина, лейцина/изолейцина и фенилаланина. В культуральной жидкости M. flagellatum в дополнение к вышеобозначенным аминокислотам также фиксировался глицин.

2

Н- и 13С-меченые суммарные белки

получали при выращивании метилотрофных бактерий в условиях аналогичным получению секретируемых аминокислот. Сбор урожая клеток проводили на стационарной фазе бактериального роста (D540 = 2.0). Содержание белка в биомассе достигало 45% при 50%-ной конверсии метилового спирта. При выделении суммарных белков биомассы учитывалось наличие примеси нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и пигментов. Нуклеиновые кислоты выделяли фенольным методом, углеводы - осаждением EtOH из 0.14 м NaCl, липиды и пигменты - экстракцией смесью органических растворителей хлороформ-МеОН-ацетон (2:1:1). В зависимости от таксономического рода штамма и содержания посторонних примесей реализовались различные подходы их выделения, включая высаливание белка 60%-ным сульфатом натрия, солюбилизацию ДДС-Na и фракционирование органическими растворителями (метанол, ацетон), ионнообменную хроматографию на катионнообменнике UR-30 и ОФ ВЭЖХ на Силасорбе С18 (степени хроматографической чистоты 93-96 при выходах 75-89%).

2

Н-меченый БР

. Основные этапы выделения 2Н-меченого БР (выход 8-10 мг из 1 г бактериальной биомассы, активность 85-90%) заключались в наработке 2Н-меченой биомассы в синтетической среде (4.3 м NaCl) с 2Н-мечеными аминокислотами, получении фракции ПМ, отделение от низко-и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов, фракционирование солюбилизированного в 2%-ном растворе ДДС-Na белка метанолом (-50С) и очистку на Сефадексе G-200 (0.09 м Трис-боратный буфер (рН 8.35) с 0.1%-ным ДДС-Na и 2.5 мМ ЭТДА). Образование ретинальпротеинового комплекса приводило к батохромному сдвигу в спектре поглощения БР (рис. 3): основная полоса при максимуме поглощения 568 нм, вызванная световой изомеризацией хромофора по С13=С14-кратной связи определяется наличием транс-ретинального остатка ретиналя БР568, дополнительная малоинтенсивная полоса при 412 нм характеризует незначительную примесь образующейся на свету спектральной формы M412 c депротонированной альдиминной связью между остатком транс-ретиналя и белком, а полоса при 280 нм определяется поглощением ароматических аминокислот в полипептидной цепи этого белка (для чистого БR соотношение D280/D568 равно 1.5:1).

Страницы: 1 2 3 4 5

Смотрите также

Структура бухгалтерской отчетности определена статьей 13 Федерального закона
Бухгалтерский баланс - документ бухгалтерского учета, представляющий совокупность показателей, характеризующих финансовое и хозяйственное состояние фирмы на определенную дату, чаще всего на конец или ...

Извлечение никеля из полировальных ванн для никелирования
При нанесении декоративных хромовых покрытий на деталь для защиты от коррозии сначала наносят слой никеля. Для получения гладкой и блестящей поверхности, необходимой для хромирования, нанос ...

Строение и свойства полимеров
Полимерные вещества внедрились во все сферы человеческой деятельности – технику, здравоохранение, быт. Ежедневно мы сталкиваемся с различными пластмассами, резинами, синтетическими волокнам ...